Антивоспалительное действие Propionibacterium acnes. Часть 2

«Эстетический Гид» публикует вторую часть перевода научной статьи ученой группы в составе

• Янхан Ван (Yanhan Wang), Тиссы Р. Хата (TissaR. Hata), Юна Ларри Тонга (Yun Larry Tong), Ричарда Л. Галло (Richard L. Gallo) с кафедры дерматологии медицинского факультета Университета Калифорнии (США),
• Мина-Шан Као (Ming-ShanKao) с кафедры биомедицинских наук и инженерии Национального Центрального Университета (Чжунли, Тайвань),
• Кристоса С. Зубулиса (ChristosC. Zouboulis) с кафедры дерматологии, венерологии, аллергологии и иммунологии Медицинского центра Дессау при Бранденбургской Медицинской Школе Теодора Фонтане (Германия),
• Чуна-Мин Хуана (Chun-Ming Huang), работающей в исследовательских центрах Калифорнии и Чжунли.

Статья посвящена Пропионовой бактерии акне и ее способности бороться как с самой угревой сыпью, так и выступать в качестве профилактического средства.

Из первой части вы узнали о том, как активируется фактор CAMP, какова его роль в появлении воспалительных реакций акне и о выработке иммунитета против P. acnes путем вакцинации фактором CAMP.

Во второй части вы сможете прочесть о наличии фактора в самих воспалительных очагах акне, а также об эффективности моноклонального антитела фактора CAMP в эксплантах акне ex vivo.
Желаем вам приятного и полезного чтения!

Наличие фактора CAMP бактерии P. acnes в очагах акне

Иммунитет, обнаруженный в мышиных ушах, не может быть полностью воспроизведен в очагах акне человека.

Экспланты акне человека предоставляют собой максимально похожую с точки зрения локального иммунного ответа и физиологии человека лабораторную модель, доступную для эксперимента в условиях среды in vivo (Nget al., 2009). Были взяты образцы щипковой биопсии непораженной и пораженной акне кожи спины пациентов с acne vulgaris (через 2-14 дней после появления воспалительных папул) (см. на Journal of Investigative Dermatology).

Очаги акне использовались для определения эксплантов ex vivo, которые провоцируют открытые поражения с утолщенными и воспаленными эпидермальными слоями (рис. 4a-c).

Сначала мы выяснили, присутствует ли фактор CAMP в очагах поражения акне. После гомогенизации общую клеточную РНК экстрагировали для количественного ПЦР-анализа с обратной транскрипцией (фиг.4d), асупернатанты использовали для анализа ELISA (рисунок 4e).

Как мРНК, так и экспрессия белка фактора CAMP бактерии P. acnes в очагах акне были значительно выше, чем в непораженной акне коже. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием моноклонального антитела (mAb) фактора CAMP бактерии P. Acnes осуществляли для выявления зоны распространения фактора CAMP в неповрежденной коже и коже с очагами акне.

Фактор CAMP также может быть обнаружен и на неповрежденной коже в волосяных фолликулах или сальных железах (рис. 4g-j), так как очаги могут располагаться повсеместно (рис. 4l-o).

Рисунок 4

Присутствие фактора CAMP Propionibacterium acnes в очагах поражения. (a) Изображения образцов биопсии (4 × 4 × 8 мм) пораженной кожи спины пациентов с acne vulgaris через 2-14 дней после возникновения воспалительных папул. Были обнаружены открытые очаги акне, пораженные волосяные стержни и эпидермальные и дермальные слои.

Поражение проиллюстрировано на верхнем снимке образца биопсии акне на поверхности эпидермиса. Шаг шкалы = 4 мм. Гематоксилин-эозиновое окрашивание показало, что эпидермис (b) пораженной акне кожи был толще, чем (с) непораженной. Шаг шкалы = 4 мм.

Экспрессия мРНК, определенная по (d) 16S рРНК P. acnes и (e) уровню белка CAMP-фактора, обнаруженные методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией и ELISA, соответственно, в пораженной коже была выше, чем в непораженной. * P <0,05 по t-критерию Стьюдента.

Изображения с высоким увеличением избранных зон (f) непораженной и (k) пораженной акне кожи показаны в g-j и l-o, соответственно. (g, l) Фактор CAMP (красная окраска) обнаруживался в волосяных фолликулах и был экспрессирован в большем количестве в (h, m) сальных железах, (i, n) эпидермисе и (j, o) дерме в коже с очаговыми поражениями, чем в непораженной коже. Шаг шкалы = 500 мкм в f и k и 100 мкм в g и l.

Оценка эффективности моноклонального антитела фактора CAMP в моделях акне ex vivo

Чтобы измерить экспрессию провоспалительных цитокинов в acne vulgaris, были количественно определены 11 цитокинов, связанных с Т-хелпером типа 1 (IFN-γ, фактором некроза опухоли-β и IL-8 [человеческий аналог мышиного MIP-2]), Т-хелпером типа 2 (IL-4, IL-9, IL-10 и IL-13), и T-хелпром типа 17 (IL-1α, IL-1β, IL-17A и трансформирующий фактор роста [TGF] -β1) в пораженной и непораженной акне коже у пациентов с угревой болезнью.

Как показано на рис.5а, уровни экспрессии мРНК восьми цитокинов (IFN-γ, фактор некроза опухоли -β, IL-8, IL-4, IL-10, IL-1, IL-1β и IL-17A) в пораженной коже были значительно выше, чем в непораженной.

Экспрессия мРНКIL-8 и IL-1β, нормализованных по отношению к показателям GAPDH (глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназы), были чрезвычайно высокими в пораженной акне коже. Уровни белка IL-8 (4 474,0 ± 901,9 пг / мг) и IL-1β (361,2 ± 93,0 пг / мг) в пораженной коже также были ощутимо выше, чем в коже без очагов акне у пациентов с угревой сыпью и нормальной кожей у здоровых людей (рис. 5b и c).

Рисунок 5

Уменьшение воспаления, вызванного Propionibacterium acnes, моноклональным антителом фактора CAMP. Образцы кожи человека были получены путем забора 4-мм щипковой биопсии у здоровых людей, а также у тех, чья кожа при наличии угревой сыпи была поражена или не поражена воспалительными очагами.

(а) Экспрессия мРНК 11 связанных с T-хелперами типа 1, 2 и 17 провоспалительных цитокинов, нормализованных по отношению к показателям GAPDH в пораженной и непораженной коже, была исследована методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией. (b, c)

Уровни белка IL-8 и IL-1β в здоровой, пораженной и непораженной коже пациентов с угревой сыпью измеряли с помощью анализа ELISA. (d, e) Образцы пораженной и непораженной кожи разрезали пополам, и половину инкубировали моноклональным антителом (IgG1) фактора CAMP бактерии P. acnes в течение 24 часов в свободной от антибиотиков кератиноцитарной среде EpiLife (ThermoFisherScientific, Waltham, MA).

Другую половину инкубировали моноклональным антителом HBsAg в качестве контрольного элемента (C). Уровни белка IL-8 и IL-1β в коже после инкубации моноклональными антителами количественно определяли с помощью ELISA. * P<0,05, ** P<0,01, **** P<0,0001 по t-критерию Стьюдента.

Инкубация эксплантов акне ex vivo моноклональным антителом фактора CAMP осуществляет прямой доступ антитела к секретируемому фактору CAMP в очагах акне. Данный метод также позволяет нам количественно оценивать провоспалительные цитокины, высвобождаемые из иммунных или кожных клеток в эксплантатах ex vivo, давая возможность задуматься об иммунотерапии с использованием вакцин фактора CAMP для лечения acne vulgaris, и подтверждает роль фактора CAMP бактерии P. acnes в патогенезе угревой болезни.

При иммуноблоттинге мы обнаружили, что моноклональное антитело фактора CAMP специфически распознает фактор CAMP бактерии P. acnes. Были собраны образцы щипковой биопсии пораженной и непораженной acne vulgaris кожи спины пациентов, как показано на рисунках 4a-e.

Чтобы вживить эксплантаты ex vivo (Nget al., 2009), образцы щипковой биопсииполностью покрывали антибиотической средой эпидермальным слоем вверх. Экспланты ex vivo пораженной и непораженной кожи инкубировали с моноклональным антителом фактора CAMP в течение 24 часов.

В качестве контрольного элемента использовали инкубацию эксплантатов exvivo с моноклональным антителом поверхностного антигена гепатита B.

Как показано на рис. 5d и е, моноклональное антитело фатораCAMP продемонстрировало способность нейтрализовать и ослаблять продуцирование как IL-8, так и IL-1β в эксплантах ex vivo, полученных из кожи, пораженной акне. Поскольку себоциты, важнейшие клетки пилосебацейного комплекса, экспрессируют IL-6 на высоком уровне, мы измеряли уровни IL-6 в эксплантах ex vivo и трехмерную культуру клеток себоцитов SZ95.

Как показано на дополнительных рисунках 3 и 4 (см. на Journal of Investigative Dermatology), коэффициент моноклонального тела фактора CAMP эффективно снижает уровни IL-6 в эксплантах акне ex vivo и вызванную P. acnes секрецию себоцитов IL-6, выращенных в трехмерной культуре.

Эти результаты подтверждают эффективность моноклонального антитела фактора CAMP бактерии P. acnes для купирования воспаления acne vulgaris.

Обсуждение

Несмотря на то, что фактор CAMP бактерии P. Acnes провоцировал гибель клеток (Huanget al., 2008), было показано, что смерть клеток является ключевым фактором, индуцирующим провоспалительные и противовоспалительные реакции при бактериальной инфекции (Pinheiroda Silvaand Nizet, 2009).

Фактор CAMP действует как порообразующий токсин, который может вызывать цитолиз и секрецию цитокинов посредством активации воспаления (Averetteet al., 2009). Токсин-индуцированная проницаемость мембраны приводит к снижению уровня цитоплазматического калия, что вызывает образование воспаления, приводя к активации каспазы-1 (Averetteet al., 2009).

Эти данные доказывают, что воспаление и цитолиз происходят вместе в инфицированных тканях. Гранулематозное воспаление, вызванное бактерией P. acnes (рис. 1c и 3b), может быть результатом поражения эпителиоидных макрофагов, окруженных лимфоцитарной манжетой (Carpinteiroetal., 2008).

Хотя кожные экспланты ex vivo использовались для инкубации моноклонального антитела в течение 24 часов в тот же день, когда они были собраны (рис. 5), было отмечено, что они демонстрируют быструю деградацию сальных желез и нарушение целостности эпидермиса и дермы после 6 дней поддержания состояния ex vivo (Nikolakiset al., 2015).

Помимо трехмерной культуры клеток себоцитов (см. на Journal of Investigative Dermatology) с подобным жировым фенотипом (Barraultet al., 2012), будут использоваться другие модели кожи с внедрением полноценной волосистой единицы (Michelet al., 1999) – это позволит изучить эффективность моноклонального антитела фактора CAMP для подавления индуцированной бактерией P. acnes секреции провоспалительных цитокинов.

Фактор CAMP - это белок, названный также CAMP-реакцией по его биологической функции. Гомология последовательностей фактора CAMP бактерии P. Acnes по отношению к другим факторам CAMP среди разных бактерий довольно низка.

Есть данные, что бактерии P. acnes типов IA, IB или II кодируют пять разных генов фактора CAMP (фактор CAMP 1-5) (Valanneet al., 2005). Фактор CAMP 2 бактерии P. acnes в этом исследовании разделяет примерно от 36 до 49% идентичности аминокислотной последовательности с другими гомологами фактора CAMP P. acnes.

Предыдущие исследования с помощью протеомики показали, что фактор CAMP 2 секретируется из всех пяти отторгаемых человеческим организмом штаммов P. acnes (Sorensenet al., 2010). Только факторы CAMP 2 и 4 обнаруживаются в секреции штамма P. acnes (KPA171202) (Sorensenet al., 2010).

Также было показано, что фактор CAMP 2 является основным активным когемолитическим фактором P. acnes, но это не относится к 4 (Sorensenet al., 2010). Так, мы можем сделать вывод, что фактор CAMP 2 важен для воспалительной реакции, вызванной P. acnes, потому что мутация фактора CAMP 2 бактерии P. acnes (рис. 1c-f) отменяет воспалительный ответ, вызванный P. acnes.

Антитела, продуцируемые мышами, привитыми фактором CAMP, действуют на секреторный фактор CAMP вместо бактериальных частиц. Как показано на рисунках 1е и f, бактериальная нагрузка в мышином ухе в разы снижалась – это означало, что вакцинация фактором CAMP может усмирить бактерии, которые также можно устранить локально, естественным путем, с помощью иммунной системы человека.

Фактор CAMP бактерии P. acnes был дифференциально экспрессирован в различных типах воспаленных acne vulgaris (Quanicoet al., 2017). Убедительных доказательств, свидетельствующих о связи экспрессии фактора CAMP со степенью тяжести акне, а также о роли фактора CAMP в патогенезе угревой болезни, нет.

Будущие исследования будут включать (I) изучение того, могут лиспецифические вакцины фактора CAMP 2 снижать воспаление, вызванное различными подтипами P. acnes, (II) определение того, являются ли антитела, выработанные при вакцинации фактора CAMP 2, перекрестно-реагирующими на другие гомологи фактора CAMP и (III) создание многовалентной вакцины, состоящей из смеси различных рекомбинантных гомологов фактора CAMP, поскольку вакцинация мышей фактором CAMP 2 не способна полностью подавить воспаление, вызванное P. acnes (рис. 3c).

Антитела фактора CAMP обнаруживаются, хотя и в малом объеме, в человеческой крови (рис. 2а).

Доказано, что предшествующие антитела, действующие совместно с комплементом, являются эндогенными адъювантами для образования защитных CD8+Т-клеток после введения вакцины против висцерального лейшманиоза (Stageret al., 2003). Предшествующие антитела респираторно-синцитиального вируса присутствовали в низких титрах в сыворотке крови человека и являлись короткоживущим антителом (Welliveret al., 1980).

Из-за относительно быстрого распада предшествующих антител после респираторно-синцитиальной вирусной инфекции респираторно-синцитиальные вирусные вакцины можно осуществлять чаще до достижения ожидаемого эффекта.

Поскольку вакцины, содержащие токсичные антигены, являются не самыми желательными для применения в медицине, будущее исследование должно включать разработку нетоксичной, но очень иммуногенной вакцины как химическим, так и генетическим способом (ShengandKong, 2012) для достижения удовлетворительных клинических результатов.

Хотя алюминий является известным адъювантом T2-хелпера, было доказано, что он вызывает либо T1-хелпер-, либо T2-хелпер-иммунный ответ (Averetteet al., 2009).

Таким образом, целесообразным будет выявить, какие популяции Т-клеток (Th1, Th2 и / или Th17) активируются путем вакцинации фактором CAMP бактерии P. Acnes с добавлением алюминия или без него.

Бактерии P. acnes стимулируют клетки кожи на продуцирование цитокинов, что приводит к воспалительному заболеванию акне (Contassotand French, 2014, Kurokawaet al., 2009, Nagyet al., 2006, Nakatsujiet al., 2011, Qinet al., 2014).

IL-17, экспрессированный в очагах поражения (Agaket al., 2014), может быть индуцирован бактериями P. acnes в мононуклеарных клетках периферической крови. В одном из недавних исследований цитокины, связанные с Th1- (IFN-γ и IL-8), Th2- (IL-10) и Th17- (IL-1β и TGF-β), были мощно активированы в очагах акне (Kelhalaet al., 2014).

Эти данные подтверждают наши результаты на рис. 5а-с, показывающие, что уровни экспрессии мРНК IL-8 и IL-1β и белка в очагах поражения были выше, чем в неповрежденной коже.

Бактерия P. acnes играет ключевую роль в развитии воспалительных поражений посредством индукции секреции IL-6 и IL-8 фолликулярными кератиноцитами, IL-1β, фактора некроза опухоли -I, IL-8 и IL-12 моноцитарными клетками зависимым от Toll-подобного рецептора 2 способом (BojarandHolland, 2004, Kurokawaet al., 2009, Leeminget al., 1988, Lheureet al., 2016, Vowelset al., 1995) и IL-1β, IL-12 и IL-23 мононуклеарными клетками периферической крови (Nget al., 2009).

Кроме того, в ответ на воздействие P. Acnes себоциты секретировали IL-8 (Nagyet al., 2006). Бактерии P. acnes вызывали смешанные ответы Th17 / Th1, индуцируя одновременную секрецию IL-17A и IFN-γ у специфических CD4+ T-клеток (Agaket al., 2014, Kistowskaet al., 2015).

Как показано на рис. 5а, экспрессия восьми цитокинов мРНК была значительно выше в очагах поражения акне по сравнению с тем же процессом в непораженной коже у пациентов с акне.

Наши результаты совпадают с предшествующими наблюдениями, показывающими активацию IFN-γ, IL-8, IL-10, IL-1β и IL-17A в очагах поражения – исследование было осуществлено путем количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (Becharaet al., 2012, Kanget al., 2005, Kelhalaet al., 2014, Kelhalaet al., 2016).

Однако наши результаты не продемонстрировали существенной разницы в экспрессии мРНК TGF-β1 между кожей, пораженной акне и кожей без очагов поражения. TGF-β1 является хорошо изученным участником патогенеза рубцевания (Klasset al., 2009), который происходит на поздних стадиях угревой болезни.

Сообщалось, что перепроизводство TGF-β1 может приводить к чрезмерному образованию рубцовой ткани и фиброзу (IgnotzandMassague, 1986). Образцы очагов поражения в этом исследовании были взяты в течение 2-14 дней после появления воспалительных папул, а не на поздних стадиях. Это объясняет, почему не было обнаружено различий в экспрессии TGF-β1 в пораженной и непораженной коже.

Несмотря на то, что триамцинолонаацетонид эффективен для снижения экспрессии TGF-β1 в клетках кожи (Carrollet al., 2002, Furuzawa-Carballedaet al., 2005), известно его неблагоприятное воздействие при инъецировании в пораженные участки (LevineandRasmussen, 1983).

Если гуманизированное моноклональное антитело фактора CAMP может быть развито, инъекция моноклонального антитела фактора CAMP непосредственно в очаги поражения может потенциально заменить триамцинолонаацетонид для внутриочаговой терапии при борьбе с acne vulgaris.

Способы вакцинации, разработанные в ходе этого исследования, могут служить эффективным средством дляусиления иммунитета против угревой болезни. Вакцинация может принести пользупациентам не только с acne vulgaris, но также и с другими заболеваниями, связанными с P. acnes, включая рак предстательной железы, полимер-ассоциированные заболевания, сепсис, токсический шок, эндокардит, остеомиелит и различные хирургические инфекции (FassiFehriet al., 2011, HaidarandNajjar, 2010, PerryandLambert, 2011, Severiet al., 2010).

Материалы и методы

Этика

Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных Национальных институтов здоровья и одобрено протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (№ S10058) в Калифорнийском университете, Сан-Диего.

Учрежденная апелляционная комиссия университета одобрила процедуру письменного информированного согласия пациента и забора образцов биопсии акне в соответствии с утвержденным протоколом (№ 121230).

Бактериальная культура

В исследовании использовались бактерии P. acnes, включая ATCC 6919, штамм P. acnes дикого типа (266; 1-1a, ST18) (Bruggemannet al., 2004) и нокаутный мутант фактора CAMP 2 (Δcamp2, [PPA0687]) (Bruggemannet al., 2004).

Масс-спектрометрия, вакцинация, нейтрализация invitro и модель акне ex vivo

Все процедуры идентификации фактора CAMP бактерии P. acnes с помощью маркировки изотопно-кодированным белком (Schmidtet al., 2005) с использованием легких (12C6) и тяжелых (13C6) форм N-никотиноилоксисукцинимида при нано-жидкостной хроматографии линейной ионной ловушки квадрупольной тандемной масс-спектрометрии (ThermoFisherScientific, Waltham, MA), экспрессию рекомбинантного фактора CAMP, вакцинацию, количественное определение титров антител, инъекции P. acnes в уши мышей, нейтрализацию in vitro, анализ ELISA, подсчет бактерий и вживление модели акне ex vivo проводили в соответствии с технологией, описанной в Nakatsujiet al. (2008a) и подробно раскрытой в дополнительных материалах.

Источник: Journal of Investigative Dermatology